Tingkatkan Akurasi Analisis Genotipe dengan ddPCR

Teknologi Droplet Digital PCR (ddPCRTM)

Teknologi Droplet Digital PCR adalah metode PCR digital yang memanfaatkan sistem droplet (emulsi air-minyak). Droplet membentuk partisi yang memisahkan molekul DNA sampel. Sampel difraksinasi menjadi 20.000 droplet dan amplifikasi PCR dari molekul DNA cetakan terjadi pada setiap individu droplet. Teknologi ddPCR menggunakan reagen dan alur kerja yang serupa dengan yang digunakan untuk sebagian besar pengujian PCR standar berbasis probe TaqMan. Droplet pada dasarnya memiliki fungsi yang sama dengan tabung atau sumur uji individu pada plate tempat reaksi PCR berlangsung, meskipun dalam format yang jauh lebih kecil. Partisi sampel secara besar-besaran adalah aspek kunci dari teknik ddPCR.

Partisi sampel adalah aspek kunci dari droplet digital PCR. Pada PCR tradisional, satu sampel hanya dilakukan satu pengukuran, tetapi pada Droplet Digital PCR, sampel dipartisi menjadi droplet sebanyak 20.000. Partisi ini memungkinkan pengukuran ribuan peristiwa amplifikasi independen dari satu sampel.

Teknologi ddPCR menggunakan kombinasi mikrofluida dan bahan kimia surfaktan eksklusif untuk membagi sampel PCR menjadi droplet. Amplifikasi PCR terjadi secara independen pada setiap droplet yang mengandung cetakan DNA dan reagen PCR. Setelah PCR, setiap droplet dianalisis atau dibaca untuk menentukan fraksi droplet PCR-positif pada sampel. Data tersebut kemudian dianalisis menggunakan statistik Poisson untuk menentukan konsentrasi cetakan DNA target dalam sampel.

Sistem ddPCR dapat digunakan untuk:

Deteksi target DNA prevalensi rendah/langka dengan sensitivitas tinggi

Menentukan variasi jumlah salinan DNA (copy number) dengan akurasi tinggi

Mengukur tingkat ekspresi gen dengan presisi tinggi

Analisis Genotipe dan Frekuensi Alel dengan Droplet Digital PCR (ddPCRTM)

Alel adalah variasi DNA (satu basa) di lokasi genomik tertentu. Setiap individu mewarisi dua alel, satu dari setiap induk. Jika kedua alelnya sama maka genotipenya disebut homozigot. Jika alelnya berbeda genotipenya disebut heterozigot.

Variasi alel dapat disebabkan oleh proses mutasi atau polimorfisme. Perbedaan utama antara mutasi dan polimorfisme adalah mutasi merupakan perubahan urutan DNA genom organisme tertentu sedangkan polimorfisme adalah variasi alel yang terjadi pada lebih dari 1% populasi. Variasi alel dapat menyebabkan perubahan fenotip, sehingga variasi alel banyak digunakan sebagai marker biologi. Analisis variasi alel atau yang dikenal dengan genotyping dapat digunakan sebagai marker biologi baik dalam bidang kesehatan, pertanian, atau peternakan, misalnya untuk resistensi terhadap patogen tertentu, efikasi obat, pewarisan sifat unggul dan lain sebagainya.

Analisis variasi alel (Genotyping) dapat dilakukan dengan teknologi berbasis PCR atau sekuensing. Umumnya teknologi sekuensing digunakan untuk proses konfirmasi setelah dilakukan amplifikasi dan analisis dengan PCR. Genotyping dengan konvensional PCR (Thermal cycler) dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi tertentu yang dapat mengenali urutan sekuens dari target basa yang akan dianalisis, dikenal dengan metode restriction fragment length polymorphism (RFLP). Analisis genotyping dengan qPCR dapat dilakukan dengan metode HRM atau berbasis PCR kompetitif spesifik alel.

Analisis genotyping dengan ddPCR menggunakan reagen yang tidak berbeda dengan qPCR , yaitu berbasis probe untuk membedakan alel mutan dan wildtype. Umumnya digunakan 2 probe yang berbeda (misal FAM dan Hex). Interpretasi data ddPCR ditunjukkan dalam bentuk plot 1D dan 2D:

1-D Fluorescence Amplitude Plots — menunjukkan total droplet pada filter 1 (FAM) dan filter 2 (HEX). Setelah ambang batas (threshold) ditetapkan, droplet negatif ditampilkan dalam warna abu-abu, sedangkan droplet positif filter 1 berwarna biru (FAM) dan droplet positif filter 2 berwarna hijau (Hex).

Sinyal digital yang dihasilkan dari floresensi digunakan untuk menghitung konsentrasi DNA target dengan analisis statistik poisson terhadap jumlah droplet positif dan negatif dalam sampel.

1-D Fluorescence Amplitude Plots dapat digunakan untuk menghitung Fractional Abundance (FA) pada aplikasi deteksi kemurnian atau kontaminasi alel mutan.

fractional abundance menunjukkan frekuensi persentase DNA mutan (alel yang ditargetkan) terhadap latar belakang DNA tipe liar (wild type) (alel yang tidak ditargetkan)

Nilai FA menunjukkan frekuensi alel mutan yang ada pada sampel. Pada kasus genotipe homozigot, idealnya 100% alel adalah versi wildtype, sedangkan genotipe heterozigot akan memiliki frekuensi alel wildtype 50% dan mutan 50%. Namun tidak jarang ditemukan frekuensi alel yang tidak sesuai ekspektasi, yang mungkin dapat berpengaruh pada regulasi ekspresi gen atau terhadap fenotip.

2-D Fluorescence Amplitude Plots. Data Droplet Digital PCR dari percobaan multipleks di mana dua target gen diamplifikasi dalam PCR, juga dapat dilihat sebagai plot 2-D di mana fluoresensi FAM diplot versus fluoresensi HEX untuk setiap droplet. Karena distribusi DNA ke dalam droplet mengikuti pola acak, droplet dikelompokkan menjadi empat kelompok:

FAM-negative, HEX-negative

FAM-positive, HEX-negative

FAM-negative, HEX-positive

FAM-positive, HEX-positive

Berbeda dengan qPCR, 2-D scatterplot pada ddPCR bukan menunjukkan genotipe sampel yang ditetapkan berdasarkan pola kluster yang terbentuk terhadap sampel standar yang telah diketahui genotipenya, tetapi menunjukkan distribusi alel yang ada pada droplet dari 1 sampel. Droplet Biru menunjukkan droplet yang hanya mengandung salinan DNA dengan alel Mutan. Droplet Oranye menunjukkan droplet tersebut mengandung salinan DNA dengan alel Mutant dan salinan DNA dengan alel Wildtype. Droplet hijau menunjukkan droplet yang hanya mengandung salinan alel DNA Wildtype. Untuk aplikasi genotyping/diskriminasi alel dengan ddPCR tidak memerlukan sampel yang telah diketahui genotipenya sebagai kontrol untuk pengelompokan genotype atau klustering. Informasi yang diperoleh juga tidak terbatas pada tipe alel yang menjadi mayoritas, tetapi dapat mengetahui frekuensi masing-masing alel pada sampel.

Penulis : Sylvia Sance Marantina M.Si
Editor : Agung Nurfaizal

Mari Terhubung dengan Kami

Phone : 021 5366 7591
Email : enquiry@sciencewerke.com
WhatsApp : 0858 8880 0005

Kunjungi media sosial Offical Sciencewerke:
Instagram: https://www.instagram.com/sciencewerke_id/
Linkedin: https://www.linkedin.com/company/pt-sciencewerke/

Back

Our News

Tingkatkan Akurasi Analisis Genotipe dengan ddPCR